BAB I PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang
Salah satu dampak dalam peningkatan ekspor komoditi pertanian
adalah kebutuhan bibit yang semakin meningkat. Bibit dari suatu varietas unggul
yang dihasilkan jumlahnya sangat terbatas, sedangkan bibit tanaman yang
dibutuhkan jumlahnya sangat banyak. Penyediaan bibit yang berkualitas baik
merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan dalam pengembangan
pertanian di masa mendatang. Salah satu teknologi harapan yang banyak
dibicarakan dan telah terbukti memberikan keberhasilan adalah melalui teknik
kultur jaringan.
Melalui kultur jaringan tanaman dapat diperbanyak setiap waktu
sesuai kebutuhan karena faktor perbanyakannya yang tinggi. Bibit dari varietas
unggul yang jumlahnya sangat sedikit dapat segera dikembangkan melalui kultur
jaringan. Pada tanaman perbanyakan melalui kultur jaringan, bila berhasil dapat
lebih menguntungkan karena sifatnya akan sama dengan induknya (seragam) dan
dalam waktu yang singkat bibit dapat diproduksi dalam jumlah banyak dan bebas
penyakit.
Kultur jaringan adalah metode perbanyakan vegetatif dengan
menumbuhkan sel, organ atau bagian tanaman dalam media buatan secara steril
dengan lingkungan yang terkendali.Tanaman bisa melakukan kultur jaringan jika
memiliki sifat totipotensi, yaitu kemampuan sel untuk beregenerasi menjadi
tanaman lengkap kembali.
I.2. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini diadakan adalah untuk mengetahui lebih
dalam mengenai perkembangbiakan vegetatif melalui kultur jaringan. Termasuk di
dalamnya tahapan dan manfaat kultur jaringan itu sendiri. Serta keterkaitan
antara teori totipotensi dengan perbanyakan melalui kultur jaringan.
I.3. Rumusan Masalah
·
Apakah prinsip dasar dalam kultur jaringan?
·
Bagaimana keterkaitan
antara teori totipotensi dengan kultur jaringan?
·
Apakah kelebihan dan kekurangan dari kultur jaringan?
·
Apa perbedaan perbanyakan alami dengan kultur jaringan?
·
Bagaimana metode pelaksanaan kultur jaringan?
I.4. Landasan Teori
Teori yang melandasi kultur jaringan ini adalah teori
totipotensi sel (Schwann dan Schleiden) yang menyatakan bahwa sel memiliki
sifat totipotensi, yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan
informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan
berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai. Teori ini mempercayai
bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembangbiak karena seluruh bagian tanaman
terdiri atas jaringan-jaringan hidup.
BAB II
PEMBAHASAN
II.1. Pengertian
Kultur jaringan bila diartikan ke dalam Bahasa Jerman disebut
Gewebe Kultur, dalam Bahasa Inggris disebut Tissue Culture, dalam Bahasa
Belanda disebut weefsel kweek atau weefsel cultuur. Kultur jaringan atau
budidaya in vitro adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman
seperti protoplasma, sel, jaringan atauorgan yang serba steril, dalam
botolkultur yang sterildan dalam kondisi yang aseptic, sehingga bagian-bagian
tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman yang lengkap.
Usaha memperoleh suatu individu baru dari satu sel atau jaringan
dikenal sebagai kultur sel atau kultur jaringan..
Kultur jaringan termasuk jenis perkembangbiakan vegetatif yang
prinsip dasarnya sama dengan menyetek. Bagian tanaman yang akan dikultur
(eksplan) dapat diambil dari akar, pucuk, bunga, meristem, serbuk sari.
II.2. Prinsip Dasar Kultur Jaringan
Menurut Thorpe (1981), ada 3 prinsip utama dalam kultur
jaringan:
« Isolasi bagian tanaman dari tanaman utuh (organ, akar, daun
dll)
« Memelihara bagian tanaman tadi dalam lingkungan yang sesuai dan
kondisi kultur yang tepat
« Pemeliharaan dalam kondisi aseptik
Teori Dasar Kultur Jaringan:
a. Sel dari suatu organisme multiseluler dimanapun letaknya sebenarnya sama
dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (omne cellula ex
cellula).
b. Teori Totipotensi Sel
Teori sel oleh Schwann dan Schleiden (1898) yang menyatakan bahwa sel memiliki
sifat totipotensi, yaitu bahwa setiap sel tanaman yang hidup dilengkapi dengan
informasi genetik dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk tumbuh dan
berkembang menjadi tanaman utuh, jika kondisinya sesuai. Teori ini mempercayai
bahwa setiap bagian tanaman dapat berkembangbiak karena seluruh bagian tanaman
terdiri atas jaringan-jaringan hidup.
II.3. Kaitan Teori Totipotensi dengan Kultur Jaringan
Teori totipotensi yang menyatakan bahwa setiap sel tanaman dapat
berkembang menjadi individu baru, digunakan sebagai dasar dalam pelaksanaan
kultur jaringan. Dalam kultur jaringan bagian tanaman yang terdiri atas sel-sel
dan jaringan dibuat sedemikian mungkin untuk ditanam di sebuah media yang
steril dan lingkungan yang terkendali. Seperti teori totipotensi tersebut,
bagian tanaman yang ditanam di media tersebut ternyata dapat bertumbuh dan
berkembang menjadi individu baru bila kondisinya sesuai.
II.4. Tipe- tipe Kultur Jaringan
Tipe-tipe kultur, yakni:
1. Kultur biji (seed culture), kultur yang bahan tanamnya
menggunakan biji atau seedling.
2. Kultur organ (organ culture), merupakan budidaya yang bahan tanamnya
menggunakan organ, seperti: ujung akar, pucuk aksilar, tangkai daun, helaian
daun, bunga, buah muda, inflorescentia, buku batang, akar dll.
3. Kultur kalus (callus culture), merupakan kultur yang
menggunakan jaringan (sekumpulan sel) biasanya berupa jaringan parenkim sebagai
bahan eksplannya.
4. Kultur suspensi sel (suspension culture) adalah kultur yang
menggunakan media cair dengan pengocokan yang terus menerus menggunakan shaker
dan menggunakan sel atau agregat sel sebagai bahan eksplannya, biasanya eksplan
yang digunakan berupa kalus atau jaringan meristem.
5. Kultur protoplasma. eksplan yang digunakan adalah sel yang
telah dilepas bagian dinding selnya menggunakan bantuan enzim. Protoplas
diletakkan pada media padat dibiarkan agar membelah diri dan membentuk dinding
selnya kembali. Kultur protoplas biasanya untuk keperluan hibridisasi somatik
atau fusi sel soma (fusi 2 protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).
6. Kultur haploid adalah kultur yang berasal dari bagian
reproduktif tanaman, yakni: kepalasari/ anther (kultur anther/kultur
mikrospora), tepungsari/ pollen (kutur pollen), ovule (kultur ovule), sehingga
dapat dihasilkan tanaman haploid.
II.5. Kelebihan dan Kekurangan Kultur Jaringan
Kelebihan:
o Sifat identik dengan induknya;
o Perbanyakan dalam waktu singkat;
o Tidak perlu areal pembibitan yang luas;
o Tidak dipengaruhi oleh musim;
o Tanaman bebas jamur dan bakteri.
Sedangkan kekurangannya:
o Bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap hama penyakit dan udara
luar;
o Bagi orang tertentu, cara kultur jaringan dinilai mahal dan sulit;
o Membutuhkan modal investasi awal yang tinggi untuk bangunan (laboratorium
khusus), peralatan dan perlengkapan;
o Diperlukan persiapan SDM yang handal untuk mengerjakan perbanyakan kultur
jaringan agar dapat memperoleh hasil yg memuaskan;
o Produk kultur jaringan pada akarnya kurang kokoh.
II.6. Perbedaan Perbanyakan Alami dan Kultur Jaringan
Alami
Nutrisi diperoleh secara alami dari dalam tanah
Tanaman dapat membuat makanannya sendiri (autotrof)
Sumber tanaman harus cukup umur
Fotosintesis dengan bantuan matahari
Ada musim hujan dan kemarau yang tidak terkendali
Kultur Jaringan
Media terbuat dari nutrisi kimia
Tanaman tidak membuat makanannya sendiri
Sumber tanaman sedikit
Fotosintesis dengan cahaya lampu
Tidak dipengaruhi musim
II.7. Peralatan Kultur Jaringan
Alat-alat yang dipakai dalam penanaman dalam kultur jaringan harus dalam
keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf.
Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran
atau dengan pemanasan dalam bacticinerator khusus untuk scapel, gagangnya dapat
disterilkan dengan pemanasan namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila
dipanaskan dalam temperatur tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan
cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.
Alat-alat kultur jaringan yang perlu disterilisasi sebelum penanaman adalah;
Pinset, Gunting, – Gagang scapel, Kertas saring, Petridish, Botol-botol kosong,
Jarum, Pipet
Peralatan kultur jaringan:
Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), alat ini letaknya di ruang penabur, yaitu
ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. alat ini digunakan sebagai tahap
perlakuan penanaman.
Entkas, merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama
seperti (LAFC)
Shaker (penggojok), merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur
menurut kemauan kita. Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan
kalus pada eksplan anggrek atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut
plb (protocorm like bodies) dari kalus bermacam jaringan tanaman.
Autoklaf, merupakan alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang
tanaman.
Timbangan Analitik, jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah
timbanagn yaang dapat dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat
keil. Alat ini berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang
digunakan untuk kultur jaringan.
Stirer, alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas.
Dengan menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai
penggojok.
Erlenmeyer, alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana
mmenuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan.
Gelas Ukur, digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan
digunakan.
Gelas Piala, digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air
suling dalam pembuatan medium.
Petridish, merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam
kultur jaringan.
Pinset dan Scalpel, pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan
eksplan atau untuk menanam eksplan
Lampu Spiritus, digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset)
di dalam laminar air flow cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan
penanaman atau sub-culture.
Tabung Reaksi, digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi
khloroplas.
II.8. Fasilitas Laboratorium Kultur Jaringan
Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi dalam beberapa bagian yang
fungsinya satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda
pula. Laboratorium kultur jaringan harus dirancang secara khusus. Karena ada
bagian-bagian atau ruangan-ruangan yang harus dalam suasana steril atau bebas
mikroba.
Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang
ada di dalamnya, yaitu sebagai berikut:
A.Ruang Tidak Steril
Ruang Tamu
Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu,
karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu
yang ingin melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli
hasil biakan kultur jaringan.
Ruang Administrasi
Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium, pembelian media
kultur jringan, penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan, dan
transaksi-transaksi ataupun perjanjian-perjanjian kerja sama tentang penelitian
dilaksanakan di dalam ruangan administrasi.
Ruang Staf
Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak,
tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan
spesialisasinya masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di
lakasanakan diskusi antar staf pada waktu berkumpul bersama.
Kamar Mandi dan WC
Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih untuk menghindari kontaminasi
oleh mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator,
tubuh dan pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu
Ruang Ganti Pakaian
Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan di
dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam
arti baru di cuci. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di
adakan ruang ganti pakaian.
Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas
Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna. Oleh
karena itu, penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah
mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan,
misalnya dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang
lama. Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk
isolasi protoplas harus disimpan dala ruangan yang sejuk. Alat-alat dari gelas
seperti erlenmeyer, gelas ukur dan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam
almari tersendiri.
Ruang Preparasi
Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat
laboratorium yang akan digunakan. Peralatan yang ada antara lain
keranjang-keranjang plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci.
Ruang Penimbangan dan Sterilisasi
Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga
yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf labolatorium lebih senang meramu
sendiri medum tanam yang dibutuhkannya.dengan demikian dibutuhkan lat untuk
menimbang semua komponen bahan kimia tersebut. Misalnya menimbang bahan kimia
makro dan mikro.
Rumah Kaca (Green House)
Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian
atasnya terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat
meletakkan pot-pot bibit tanaman.
B. Ruang Tidak Mutlak Steril
Ruang Planlet
Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC), maka temperatur ruangan dapat
mencapai sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet. Botol-botol yang
berisi planlet jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh sebab itu, dalam ruangan
ini perlu disediakan rak-rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk
meletakkan botol-botol tersebut secara teratur dan rapi.
Ruang Inkubator
Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau
pertumbuhannya setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang
keadaannya lebih steril dari ruang planlet, yaitu ruang inkubator. Ruang
inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan
lampu-lampu neon, karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi
membutuhkan temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan
jenis eksplannya.
Ruang Shaker dan Enkas.
Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan
menghasilkan kalus. Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi
sel, yaitu menumbuhkan suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair
(media yang tidak menggunakan zat pemadat atau agar), kemudian digojok di atas
shaker. Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam
istilah asing disebut plb (protocorm like bodies). Bentuk protocormus adalah
bulat-bulat padat dan berwarna hijau. Bila keadaan protocormus sudah keadaan
demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam media padat untuk di tumbuhkan
menjadi planlet. Enkas juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker,
kegunaan enkas ini sama dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur
eksplan.
C. Ruang Mutlak Steril
Ruang Penabur
Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar, yaitu
2×3 m2. tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak
membutuhkan waktu yang lama dan tidak mengalami kesulitan.
Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin, sehingga sterilisasi mudah
dilakukan. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96%
dengan hand-sprayer. Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel
yang dibasahi alkohol 96%. Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang
ruang penabur akan digunakan.
Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus
dimatkan terlebih dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur
diperbolehkan memasuki ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu
neon di matikan dan setelah keluar menutup daun pintu kembali lampu ultra
violet dinyalakan. Dengan demikian steril ruangan dapat dijamin.
II.9 Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan
Metode Kultur Jaringan:
1. Dilihat dari Macam Media Tanam
Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu:
a. Metode Padat (Solid Method)
Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan
medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga
kalus dapat tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung
semua komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan
dengan menambahkan zat pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar
batangan, agar-agar bubuk, atau agar-agar kemasan kaleng yang yang memang
khusus digunakan untuk media padat untuk kultur jaringan.
Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit
untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan
menyebabkan kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya
eksplan yang ditanam. Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi
kalus, karena tempat area kalus yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup
oleh medium.
Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas
stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah
dipindahkan dari suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang
sudah difusikan (digabungkan).
b. Metode Cair(Liquid Metho)
Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat,
karena untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga
keberhasilannya sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat
berhasil.
Oleh karena itu, penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel,
yaitu untuk menumbuhkan plb (prtocorm like bodies). Dari protokormus ini
nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila dipindahkan kedalam media padat
yang sesuai.
Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak p
erlu memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan
zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.
2. Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai
Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang
telah dikenal sekarang antara lain adalah:
1) Kultur meristem.
2) Kultur antera
3) Kultur endosperma
4) Kultur suspensi sel
5) Kultur protoplas
6) Kultur embrio
7) Kultur spora
8) Dan lain-lain
3. Dilihat dari Cara Pemeliharaan
Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian
menjadi planlet, membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. Artinya,
eksplan atau kalus yang sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang
baru harus segera dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang
terlambat dapat menyebabkan pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau
dapat mengalami brownig atau terkontaminasi oleh jamur atau bakteri.
II.10.Tahapan Kultur Jaringan
Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat pendukung kehidupan
jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh
yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil
nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai
bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua
penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya
berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair
adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau
dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan.
Pelaksana harus bekerja dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan
pekerjaan tersebut memerlukan penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan
tersendiri.
Tahapan tersebut, yaitu:
a. Inisiasi Kultur
Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur
dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell,
1976). Ini mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Aseptik berarti bebas
dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang
tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang
dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan
dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat,untuk
perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell, 1976).
Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya
pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini disebabkan
oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat
pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Senyawa fenol
tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan
jaringan eksplan.
b. Sterilisasi
Sterilisasi adalah proses pembebasan dari mikroorganisme.
Tujuan sterilisasi yaitu untuk menciptakan kondisi kultur yang steril.
Tahapan Sterilisasi:
1. Sterilisasi peralatan gelas dan stainless dalam suhu 121o di dalam autoklaf.
2. Sterilisasi bahan tanaman
Tanaman induk – sterilisasi bahan tanam/eksplan menggunakan detergen, alcohol,
kloroks 0,5 % dll – direndam dalam bahan sterilant – sterilisasi dalam laminar –
tanaman dipro-kondisi
c. Pembuatan media kultur
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan
diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin,
dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan
lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik
jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.
Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.
Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan
autoclave.
Tahapan pembuatan media kultur:
o Persiapan bahan
o Formulasi
o Pengukuran pH (5,7-5,8)
o Pemberian agar-agar dan pemanasan media
o Penuangan dan penutupan media -> sterilisasi
Kandungan nutrisi dalam agar-agar :
1. mineral :
- Makro
nutrient (N, P, K, Ca, Mg)
- Mikro
nutrient (Mn, Zn, Mo, Cu, Co)
2. karbohidrat (gula)
3. vitamin (B dan C)
4. protein
5. hormon
Komposisi media Murashige dan Skoog (MS)
Bahan Kimia Konsentrasi Kimia (mg/l)
1. NH4NO3 1650
2. KNO3 1900
3. CaCL2+2H20 440
4. MgSO4+7H20 370
5. KH2PO4 170
6. FeSO4+7H20 27
7. Na 37,3
8. MnSO4+4H20 22,3
9. ZnSO4.7H2O 8,6
10. H3BO3 6,2
11. KI 0,83
12. Na2MoO4+2H20 0,25
13. CuSO4+5H20 0,025
14. CoCl2+6H20 0.025
15. Myoinositol 100
16. Niasin 0,5
17. Piridoksin-HCL 0,5
18. Tiamin-HCL 0,1
19. Glisin 2
20. Sukrosa 30000
d. Penanaman eksplan
Melalui sub kultur atau transfer, tanaman ditanam pada media tanam di laminar
air flow menggunakan alat-alat yang steril.
Syarat eksplan yang baik:
§ Berasal dari induk yang sehat dan subur
§ Berasal dari induk yang diketahui jenisnya
§ Tempat tumbuh pada lingkungan yang baik
§ Ukuran tunas optimal sekitar 5 cm tingginya
§ Tunas langsung diproses sesegera mungkin
Tahapan sub kultur:
o Induksi tunas
Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat
dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman indukan sumber eksplan tersebut harus
dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca atau greenhouse agar
eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas dari
sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in-vitro.
o Multiplikasi tunas
Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan
pada media. Ini dilakukan untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan
gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung yang telah ditanami eksplan diletakkan
pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.
o Pengakaran
Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar
yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan
baik. Untuk pengakaran digunakan media MS + NAA. Pengamatan dilakukan setiap
hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya
kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Proses perakaran pada umumnya
berlangsung selama 1 bulan. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala
seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan
bakteri).
o Inkubasi
Pada tahap inkubasi, eksplan ditempatkan di
ruang/lingkungan yang terkendali (untuk duji keberhasilannya).
Suhu yang sesuai untuk pertumbuhan kultur adalah antara 24–28oC. Untuk
mengkondisikan ruang inkubasi pada suhu yang diinginkan, maka di dalam ruangan
tersebut dipasang Air Conditioner (AC).
o Aklitimasi
Aklitimasi merupakan proses adaptasi/pemindahan tanaman dari lingkungan dalam
ke lingkungan luar (dari lingkungan yang terkendali ke lingkungan yang tidak
terkendali).
Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan
sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan
hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap
serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan
lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan
bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.
Pada saat aklimatisasi ini umumnya 2 minggu dengan sungkup dan 4 minggu tanpa
sungkup. Dan pada saat itu planlet sudah mencapai tinggi 20 – 25 cm.
Selanjutnya bibit siap ditumbuhkan dalam polibag. Setelah itu tanaman perlu
ditumbuhkan di nursery sampai mencapai tinggi 50 – 60 cm kemudian dipindahkan
ke lapangan
II.11.Faktor yang Mempengaruhi Proses Regenerasi
1. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro: pucuk aksilar, pucuk
adventif, embrio somatik, pembentukan protocorm like bodies, dll
2. Eksplan
Merupakan bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk perbanyakan
tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur eksplan,
letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat digunakan
sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil,
endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.
3. Media Tumbuh.
Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur
tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur
jaringan, antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM),
Knop, Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah
MS.
4. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman
Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan
penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering
digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene
Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin
seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA.
Golongan Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti
Ancymidol, Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.
5. Lingkungan Tumbuh
Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi
temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan
ukuran wadah kultur.
II.12.Kendala dan Masalah Melakukan Kultur Jaringan
Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh
para petani, baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba
melaksanakannya, karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan
keterampilan khusus dan harus dilatar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar
tentang fisiologi tumbuhan, anatomi tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian.
Dengan demikian jelas akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani
biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik kultur jaringan mutlak memerlukan
laboratorium khusus, walaupun dapat di usahakan secara sederhana (dalam ruang
yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan yang memadai. Kemungkinan lain
petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik..
Pekerjaan kultur jaringan meliputi: persiapan media, isolasi bahan tanam
(eksplan), sterilisasi eksplan, inokulasi eksplan, aklimatisasi dan usaha
pemindahan tanaman hasil kultur jaringan ke lapang. Pelaksana harus bekerja
dengan teliti dan serius, karena setiap tahapan pekerjaan tersebut memerlukan
penanganan tersendiri dengan dasar pengetahuan tersendiri. Karena semua
pekerjaan harus dilaksanakan secara hati-hati dan cermat serta memerlukan
kesabaran yang tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman secara in
vitro ini juga sangat mahal, kecuali kita meramu medium sendiri. Bila kita
terpaksa harus membeli medium yang sudah jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat
mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di impor dari luar negeri.
Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi protoplas,
tentu biayanya akan bertambah besar. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur
jaringan juga masih dibeli dari luar negeri seperti Jepang.
Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas, kita harus mengakui bahwa
teknik kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan, terutama
untuk pengembangan bioteknologi.
Masalah-masalah Dalam Kultur Jaringan
Dalam kegiatan kultur jaringan, tidak sedikit masalah-masalah yang muncul
sebagai pengganggu dan bahkan menjadi penyebab tidak tercapainya tujuan
kegiatan kultur yang dilakukan. Gangguan kultur secara umum dapat muncul dari
bahan yang ditanam, dari lingkungan kultur, maupun dari manusianya.
Permasalahan dalam kultur ada yang dapat diprediksi sebelumnya dan ada pula
yang sulit diprediksi kejadiannya. Untuk yang tidak dapat diprediksi, cara
mengatasinya tidak dapat secara preventif tetapi diselesaikan setelah kasus itu
muncul.
Adapun masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan yaitu:
1) Kontaminasi
Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur
jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah merupakan
sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang diperkaya.
Fenomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari
jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll).
Upaya mencegah terjadinya kontaminsi:
- Biasakan
membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur jaringan.
- Yakinkan
bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.
- Lakukan
proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu yang
longgar.
2) Pencoklatan/browning
Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering
membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa
pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering
terjadi.
Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi eksplan
dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan.
3) Vitrifikasi
Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan:
Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidaknormal.
Tanaman yang dihasikan pendek-pendek atau kerdil.
Pertrumbuhan batang cenderung ke arah penambahan diameter
Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent.
Pada daunnya tidak memiliki jaringan pallisade..
4) Variabilitas Genetik
Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam
dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upaya pemuliaan tanaman maka
variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in
vitro karena:
Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur
berulang yang tidak terkontrol
Penggunaan teknik yang tidak sesuai.
Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur -suspensi
sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin
akibat teknis kultur, media atau hormon.
Cara mengatasi masalah variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus
memperhatikan aspek yang dikulturkan.
5) Pertumbuhan dan Perkembangan
Masalah utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang
ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak
mati tetapi tidak tumbuh.
Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan
tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan
eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari
sel-sel tua yang muda kembali.
Media juag dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari
kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses
pembelahan dan pembesaran dirinya.
Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan
pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik dari
sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen.
6) Praperlakuan
Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja,
pertumbuahn dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa
dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan
muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan. Prapelakuan dilakukan
umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah dalam rangka
menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan kemikalis, fisik,
biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus dimulai dari
pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan alternatif
pengelolaannya.
7) Lingkungan Mikro
Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering
menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi pertumbuhan
eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi pertumbuhan
dan perkembangan pada eksplan.
Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda,
namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator
suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara
satu ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan
tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain.
BAB III PENUTUP
III.1.Kesimpulan
Pada dasarnya, kultur jaringan merupakan suatu tehnik membiakkan
sel atau jaringan ke dalam media kultur, sehingga tumbuh, membelah, dan
menghasilkan tumbuhan baru dengan cepat dan memiliki sifat yang sama dengan
induknya.
Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan mengisolasi bagian
tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut
dalam media buatan secara aseptic yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh
dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat
memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari
teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif
tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.
Dalam kultur jaringan digunakan eksplan, yaitu sel atau irisan jaringan tanaman
yang akan menjadi benih tanaman yang baru nanti setelah di kultur jaringan.
Faktor eksplan yang perlu diperhatikan adalah genotipe/varietas, umur eksplan,
letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat
digunakan sebagai eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon,
hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.
Tanaman yang dimanfaatkan dalam kultur jaringan harus memiliki sifat Autonom,
dan sifat Totipotensi.
- Autonom
artinya dapat mengatur aktivitas hidup sendiri, sehingga tumbuhan yang
bersifat Autonom akan dapat mengatur aktvitas yg dilakukannya sendiri.
- Totipotensi
artinya kemampuan setiap sel tumbuhan untuk menjadi individu yang sempurna
atau untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Jadi sifat
totipotensi ( total genetic potential) sel, yaitu bahwa setiap sel tanaman
yang hidup dilengkapi dengan informasi genetik dan perangkat fisiologis
yang lengkap untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh, jika
kondisinya sesuai.
Prinsip dasar Kultur Jaringan yaitu :
a. Sel dari suatu organisme multiseluler dimana pun letaknya, sebenarnya sama
dengan sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (Setiap sel berasal dari
satu sel).
b. Teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki
potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan
berediferensiasi menjadi tanaman lengkap. Teori ini mempercayai bahwa setiap
bagian tanaman dapat berkembang biak.karena seluruh bagian tanaman terdiri atas
jaringan – jaringan hidup.
Sedangkan Tahap-tahap pada kultur jaringan tanaman yaitu :
a. Inisiasi kultur
b. Sterilisasi
c. Pembuatan media kultur
d. Penanaman eksplan
e. Inkubasi
f. Aklitimasi
Peralatan Kultur Jaringan:
- Laminar
Air Flow Cabinet (LAFC)
- Entkas
- Shaker
- Autoklaf
- Timbangan
Analitik
- Stirer
- Erlenmeyer
- Gelas
Ukur
- Gelas
Piala
- Petridish
- Pinset
dan Scalpel
- Lampu
Spiritus
- Tabung
Reaksi
Faktor yang Mempengaruhi Proses Regenerasi
1. Bentuk Regenerasi
2. Eksplan
3. Media
4. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman
5. Lingkungan Tumbuh
Masalah-masalah yang dapat terjadi dalam kultur jaringan:
- Kontaminasi
- Pencokelatan/browning
- Vitrifikasi
- Variabilitas
Genetik
- Masalah
dalam pertumbuhan dan perkembangan eksplan
- Masalah
dalam properlakuan
- Masalah
dalam lingkungan mikro
III.2.Saran
Pelaksanaan kultur jaringan di Indonesia belum cukup banyak dilakukan. Hal ini
dikarenakan kurangnya dana dan fasilitas. Saya menyarankan kepada pemerintah,
sebaiknya pemerintah ikut memperhatikan masalah mengenai pertanian terutama
dalam metode kultur jaringan yang seharusnya dapat menghasilkan keberhasilan
yang besar. Juga kepada SMAN 1 Purwakarta, untuk mengagendakan pembuatan
laboratorium kultur jaringan di masa yang akan datang supaya para murid dapat
dengan mudah mempraktekkan teori yang didapat mengenai kultur jaringan. Saya
harap saran dipertimbangkan.
